Topp 3 sekvensielle trinn av polymerasekjedereaksjon (PCR)

Følgende punkter markerer de tre øverste trinnene i polymerasekjedereaksjonen (PCR). De sekvensielle trinnene er: Denaturering 2. Annealing 3. Forlengelse av DNA.

Sekvensielt trinn # 1. Denaturering:

Det første trinnet er å denaturere DNA (både Primer DNA og Native DNA). Separasjon av to DNA-tråder er kjent som denaturering mens to sammenhenger bringes til å kalles som re-annealing eller hybridisering (figur 48.1). Oppdagelsen av denaturering og re-annealing av DNA ble gjort kunstig av Marmor og Lane (1960).

Ifølge dem kunne det dobbeltstrengede DNA separeres i to separate enkeltstrenger (denaturering) ved oppvarming ved høy temperatur (90-95 ° C) og hybridisering eller sammenføyning av to DNA-streng (dobbeltstrenget DNA) som er mulig ved reduserer temperaturen (50-56 ° C).

Dette er hovedprinsippet som PCR-funksjonen fungerer på. Det andre prinsippet er forlengelse av primeren ved hjelp av DNA-polymeraseenzym.

Det native DNA-, primer- og DNA-polymeraseenzymet (Tag-polymerase) blir tilsatt i et PCR-rør og temperaturen heves og senkes i PCR-maskinen for å denaturere og hybridisere.

Sequential Step # 2. Annealing:

Etter denaturering av DNA er neste trinn å tillate at syntetiser primeren til anneal mot de motsatte DNA-strengene av den ønskede målsekvens. Annealing (hybridisering) kan oppstå hvis temperaturen fra 95 ° C senkes til 50/56 ° C. Temperaturen blir så brakt ned i maskinen.

Så snart temperaturen senkes, vil de native DNA-strengene ikke bare bindes sammen, men også binde primrene. Denne spesifikke hybridiseringen, eller "rekombination" av komplementære nukleotider, gir både begrunnelse og det praktiske grunnlag for mye av rekombinant DNA (figur 48.2).

Sekvensielt trinn # 3. Forlengelse av DNA (Taq Polymerase Enzy er nødvendig):

Etter at primrene har annealed, bør de forlenges ved bruk av oligonukleotidprimeren som startpunktet. beskrevet at enzym-DNA-polymerase er nødvendig for syntese av DNA. Derfor, for utvidelse av primer trenger vi en termostabil DNA-polymerase slik at enzymet ikke ødelegges ved høy temperatur.

Termostabil polymerase (Taq polymerase) isoleres fra Thermus aquaticus. Taq-polymerasen har en enorm fordel ved utførelse av PCR-reaksjonen. Den har en optimal aktivitetstemperatur på rundt 70 ° C, og det skal ikke tilsettes fersk enzym til hvert reagensrør etter oppvarming og kjøling.

Termisk stabil DNA-polymerase fremstilles nå av forskjellige firmaer med forskjellige kilder (annet enn Thermus aquaticus) under forskjellige handelsnavn (TM). For forlengelsen av primer blir den termostabile DNA-polymerase tilsatt i røret og temperaturen heves deretter til 65-70 ° C.

Etterfølgende sykluser av strengseparasjon (denaturering), primerhybridisering (annealing) og strengsyntese (forlengelse) sikrer eksponensiell forsterkning av målsekvensene ved bruk av den amplifiserte sekvensen hvis den forrige syklus som en ny mal, det er tre sykluser (figur 48.2 ).

Primer Making:

Primerne er kort sekvens (ofte RNA) brukes til å lage to nukleotider, referert til primer, med en for hver ende av DNA-fragmentet og gir en fri 3-OH-ende der en DNA-polymerase starter syntese av en deoksyribonukleotidkjede.

En sekvens er laget i retningsretningen, mens den andre er laget i anti-sense retning. (Figur 48.2). Primeren brukes til å prime syntesen av gratis DNA-tråder og utformes slik at DNA mellom primrene er fragmentet av interesse som skal amplifiseres.

Hvis messenger-RNA (mRNA) amplifiseres, må den omdannes til gratis DNA (cDNA) ved en RNA-avhengig DNA-polymerase, revers transkriptase. CDNA-komplekset blir deretter omgjort til dobbeltstrenget DNA, og blir mal for en etterfølgende PCR-reaksjon.

Dette er ofte kjent som reversert transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT PCR). Primrene kan genereres kunstig eller kan kjøpes fra firmaene.

Etter at reaksjonen er fullført, kan de amplifiserte produktene (DNA) bli visualisert ved gelelektroforese. Den viktige fysiske egenskapen til DNA-molekylet er at hvert enkelt nukleotid har en netto negativ ladning som resulterer fra fosfatgruppen.

Dermed fragmenter av forskjellig størrelse utsatt for et elektrisk felt har en tendens til å migrere mot den positive elektroden i forskjellig hastighet avhengig av størrelsen, med små fragmenter som migrerer raskere enn den større. Denne prosessen med separasjonsbasert elektrisk ladning kalles elektroforese.

DNA-prøvene, etter å være fordøyd til fragmenter av forskjellige størrelser med et restriksjonsenzym (endonuklease), tilsettes til bærermedium, slik som agrosegel eller akrylamid. Porene av gelen avhenger av prosentandelen og kan sammenlignes med en (molekylær) sik. Dermed er migrasjonshastigheten av DNA-fragmentene gjennom gel avhengig av både DNA-fragmentstørrelse og påført spenning.

Prosedyren for å separere og trekke fra spesifikt DNA-fragment er Southern blotting. Betydningen av denne teknikken er at enkeltstrengfragmentet kan overføres ved kapillærvirkning til et fast underlagsmiddel (Nylon eller cellulosemembran) og permanent festet ved oppvarming (figur 48.3).

Etter elektroforese kan DNA-mønsteret visualiseres under UV-lampe etter behandling med etidiumbromidflekk; Etidiumbromidet er et fluorescerende fargestoff. Agrose gelelektroforese utmerker fragmenter fra 100 basepar til 60000 basepar (60 kb), mens polyakrylamidgeler effektivt separerer fragmenter enn 1000 basepar (1 kb).

Pulse-gelelektroforese (PFGE) har gjort det mulig å separere DNA-fragmenter til og med opptil 2kb. I denne prosedyre blir det elektriske feltet endret i forskjellige retninger som tvinger molekylene av DNA til å omdirigere mellom hver puls eller elektrisk strøm. Dette er den beste teknikken for å identifisere et kjent gen.

Endonukleaser kan gjenkjenne 3, 4, 5, 6 eller 8 basepar og er tilgjengelige i markedet.

PCR buffere / salter.

For Taq DNA-polymerase fremstilles bufferen som nedenfor:

50 mM KCI

10 mM Tris-HCl ved romtemperatur

Dimetylsulfoksid (DMSO) og glykol brukes som samløsningsmiddel i PCR-buffere når målet har svært høy denatureringstemperatur.

Deoksynukleotidtrifosfat (dNTPs) er ionekofaktorer.

Nå tilbyr bioteknologiselskaper forberedte løsninger.

Grunnprinsippet er beskrevet som følger:

Det er fire dNTPs, dATP (adenintrifosfat), dCTP (cytosin), dGTP (gunine), dUTP (uracil) som brukes i henhold til basisparreglene for å forlenge primeren og til slutt å kopiere målsekvensen.

DNTP binder med Mg ²⁺ . Mengden av dNTP som er tilstede i en reaksjon, bestemmer mengden av gratis Mg2 ⁺ tilgjengelig for optimal enzymaktivitet. DNTP-løsningene bør nøytraliseres med Tris base til pH 7, 0 og konsentrasjonen av disse bør bestemmes spektrofotometrisk.

Substrat og substratanaloger:

Taq polymerase fungerer (dNTP) veldig effektivt. Imidlertid er det noen modifiserte substrater tilgjengelige i stedet for Tag DNA polymerase substrat. De er dogoksigenin- dNTP, biotin-11-dUTP, C7deaza-dGTP og fluorescensmerket dNTPS.

Følgende typer PCR er generelt:

(1) Nested PCR;

(2) RT-PCR;

(3) Anker-PCR;

(4) asymmetrisk PCR;

(5) Inverse PCR;

(6) DOP-PCR.