Enzyme-Linked Immnoabsorbent Assay (ELISA) Metoder for Detektering av Antigen
Enzyme-Linked Immnoabsorbent Assay (ELISA) Metoder for å Detektere Antigen!
Enzym-koblet immnoabsorberende metode kan brukes til å oppdage enten antigen eller antistoff. ELISA-metoden har mange fordeler i forhold til andre metoder (tabell 27.2).
ELISA-metoden er 10 til 1000 ganger følsom enn de eldre metodene som agglutinering og immunoelektroforese. En rekke modifikasjoner av ELISA er tilgjengelige, hvorav noen er beskrevet her.
Tabell 27.2: Fordeler med enzymimmunoassays
1. Forsterkningseffekt av enzymer resulterer i utvikling av mer sensitive analyser
2. Reagenser har lang holdbarhet og er relativt billig
3. Et bredt utvalg av analysekonfigurasjoner kan utvikles
4. Utstyr er mindre kostbart og tilgjengelig i stor utstrekning
5. Ingen strålingsfarer
6. Kan også utføres i små laboratorier
ELISA til assay antistoffer:
Kjent antigen er belagt på en mikroliter platebrønner (liten plastplate, behandlet for å maksimere proteinbindingen, inneholder 96 brønner med et volum på 200 pl).
↓
Humant test serum blir tilsatt til brønnen og inkubert.
Jeg. Hvis serumet inneholder antistoffer mot det belagte antigenet, binder antistoffene til antigenene.
↓
Brønnene vaskes for å fjerne ubundne serumkomponenter.
↓
Enzymkonjugert anti-humant immunglobulin (kjent som konjugat) tilsettes brønnene og inkuberes.
ii. Konjugatet binder til antigenbundne antistoffer i brønnen.
iii. Hvis testserumet ikke inneholder antistoffer mot antigenet, forblir konjugatet i løsningen.
↓
Brønnene vaskes for å fjerne ubundet konjugat.
↓
Et egnet substrat tilsettes til brønnene og inkuberes.
iv. Enzymet av konjugatet i antigen-antistoff-konjugatkomplekset virker på substratet og splitter substratet for å produsere et farget produkt. Utvikling av farge indikerer at antistoff spesifikt for antigenet belagt på brønnene er til stede i testserumet.
v. Ikke-fargeutvikling indikerer at testserumet ikke har antistoffer mot antigenet belagt på brønnene.
↓
En stoppløsning (vanligvis IN svovelsyre) tilsettes for å stoppe reaksjonen. Deretter holdes platen i en ELISA-leser og den optiske tettheten (OD) til brønnene måles. OD-verdien tilsvarer mengden av antistoff i testserumet.
Ved å bruke kjente konsentrasjoner av antistoffer, kan en graf konstrueres. Antistoffkonsentrasjonene er plottet på X-aksen, og de tilsvarende OD-ene er plottet på Y-aksen, og en kurve tegnes. Ved å interpolere OD-verdien av testserumet bestemmes konsentrasjonen av antistoffer i et testserum.
ELISA til assay antigen:
Et kjent monoklonalt antistoff (referert til som primært antistoff) til et antigen, er belagt på mikrotiterbrønnene.
↓
Prøven som skulle inneholde antigenet ble tilsatt til brønnen og inkubert.
Jeg. Hvis prøven inneholder det tilsvarende antigenet binder antigenet til antistoffet på brønnen og danner et antigen-antistoffkompleks.
↓
Brønnene vaskes for å fjerne ubundne materialer.
↓
Et kjent enzymkonjugert mAb (kalt som konjugat) mot antigenet tilsettes brønnene og platen inkuberes.
Jeg. Hvis brønnen inneholder antigen-antistoffkompleks, binder konjugatet til antigenet i komplekset.
ii. Hvis det ikke er noe antigen-antistoffkompleks, forblir konjugatet i oppløsning.
↓
Brønnene vaskes for å fjerne ubundet konjugat. Et egnet substrat tilsettes og inkuberes.
Jeg. Hvis det er konjugat i brønnen, sprer enzymet av konjugatet substratet og produserer et farget produkt.
iii. Fravær av fargeutvikling indikerer at det ikke er noe antigen i prøven (mot antistoffbelagt på brønnene).
↓
En stoppløsning blir tilsatt for å stoppe reaksjonen. ODs av de enkelte brønner leses i ELISA-leseren. Som tidligere forklart er en graf (bestående av forskjellige konsentrasjoner av antigener på X-aksen og de tilsvarende OD på Y-aksen) konstruert og kurven tegnet. Konsentrasjonen av antigenet i testprøven bestemmes ved interpolering av dens OD.
Antibody Capture ELISA Metode:
Brønner av mikrotiterplaten er belagt med anti-humane IgM-antistoffer.
↓
Pasientens serum blir tilsatt og inkubert. IgM-antistoffene i serum binder til anti-humane IgM-antistoffene på brønnene.
Brønnene vaskes og deretter blir et kjent antigen tilsatt og inkubert.
Jeg. Hvis IgM antistoffer mot antigenet er tilstede i brønnen, vil antigenet binde til IgM antistoffet og forbli i brønnen.
↓
Brønnene vaskes for å fjerne ubundet antigen
↓
Et enzymkonjugert mAb til antigenet tilsettes og inkuberes.
Jeg. Hvis antigen er til stede i brønnen (anti IgM-IgM-antigen-komplekset), vil konjugatet binde til antigenet.
↓
Brønnene vaskes for å fjerne ubundet konjugat og substrat tilsettes.
Jeg. Fargeutvikling indikerer at IgM-antistoffer mot antigenet er tilstede i pasientens serum.
ii. Ikke-fargeutvikling indikerer at pasientens serum ikke inneholder IgM-antistoffer mot antigenet.
↓
Stoppløsning legges til og OD-brønnene måles individuelt i ELISA-leseren. Mengden IgM antistoffer mot antigenet kan bestemmes ved å tegne en graf som beskrevet tidligere.
En lignende prosedyre kan anvendes for å detektere IgG-antistoffer mot et antigen.
De enzymer som vanligvis brukes i ELISA-teknikkene, er pepperrotperoksidase og alkalisk fosfatase (tabell 27.3). Disse enzymene er kovalent koblet til mAbs. En rekke substrater blir påvirket av disse enzymene for å produsere fargede produkter. Siden det siste trinnet i ELISA-metoden er enzymatisk, er ELISA-metoden ekstremt følsom (dvs. svært lave konsentrasjoner av antigen eller antistoff er påviselige).
Følsomhet av ELISA-analyser forbedres ved bruk av ytterligere reagenser (for eksempel biotin / avidinimmunoassay). Nylig har bruken av pepperrotperoxidase-substrater som produserer kjemiluminescerende produkter ytterligere forbedret følsomheten. Måling av reaksjonshastigheten, i stedet for reaksjonens omfang ved et enkelt fast øyeblikk, gir mer nøyaktige kvantitative ELISA-resultater.
Tabell 27.3: Kjennetegn på enzymer som brukes i enzymimmunoassays:
Kjennetegn | Pepperrotperoksidase | P-galaktosidase | Alkalisk fosfatase |
Kilde | Pepperrot | Escherichia coli | Bovintarmen |
MW (dalton) | Ca.40, 000 | Ca.530, 000 | 140000 |
Spesifikk aktivitet | 250U / mg | 600 U / mg | 1000 U / mg |
Omløpshastighet | 10000 | 318000 | 250000 |
Enzymåling | Colorimetry, fluorometri, luminometri | Colorimetry, fluorometri, luminometri | Colorimetry, fluorometri, luminometri |
Enzymmerking | Periodisk oksidasjon | Dimaleimidmetode, kryssbindingsreagens | Glutaraldehydmetode, kryssbinding |
Biotin-Avidin Forbedret ELISA:
I stedet for å merke mAb med et enzym, kan MAb bli merket med biotin (Vitamin B 12 ).
↓
Deretter blir enzymet merket avidin (en proteinkomponent av egghviten) tilsatt.
↓
Avidin binder seg til biotin med svært høy følsomhet og affinitet. Deretter blir substratet tilsatt. Enzymet (i mAb-biotin-avidin-enzym) komplekset virker på substratet og frembringer et farget produkt.
Biotin-avidinforbedring brukes også i immuno-fluorescerende analyser.
Microparticle Enzyme Immunoassays:
I stedet for å belegge mikrotiterplatebrønnene med antigener eller antistoffer, blir små perler (1 mm i diameter) belagt med antigen eller antistoff, og ELISA-analyser utføres. Mikropartiklene gir større overflateareal for antigen eller antistoffbelegg, slik at høyere konsentrasjoner av antigen eller antistoff kan belegges, hvilket bidrar til å forkorte tiden som kreves for bindingsreaksjoner.
Fluorescerende enzymimmunoassay er identisk med andre EIAer, bortsett fra at de bruker fluorescerende substrater. I fluorescerende EIA genereres fluoroforet ved en enzymreaksjon. Etter eksitering av fluoroforen ved sin optimale bølgelengde blir lys ved en karakteristisk bølgelengde utsendt. Det emitterte fluorescerende lyset måles.
Tidsløst Fluoroimmunoassay:
Denne metoden trenger spesiell instrumentering og spesielle fluorescerende etiketter for å øke analysens følsomhet. Det fluorescerende merket som benyttes i denne analysen, viser en forsinket fluorescens med en tidsperiode på 100 ns eller mer mellom eksitasjon og utslipp. De fleste stoffer som er ansvarlige for bakgrunnsfluorescensen, har en kort forfallstid. Derfor vil måling av det forsinkede fluorescenssignalet redusere effekten av bakgrunnsfluorescens.
Denne hensikten oppnås ved bruk av spesielle tidsbestemte fluorometer som gir en rask lyspuls som exciterer fluoroforen. Fluorescens måles en liten stund etter eksitering. Dermed kan effekten av ikke-spesifikk bakgrunn, som generelt faller på mindre enn 10 ns, elimineres.
Fluorforene som utviser forsinket fluorescens er:
Jeg. Pyrenederivater med en nedbrytningstid på nesten 100 ns.
ii. Sjeldne jordmetallkelatetiketter [som europium (Eu 3+ ), samarium (Sm 3+ ) og terbium (Tb 3+ )] som har en meget lang forfallstid på ca. 50 til 100 μs.
Kjemiluminescerende immunanalyse:
Kjemiluminescerende immunoassays (CL-EIAs) bruker kjemiluminescerende substrater som reagerer med forskjellige enzymer. Den kjemiluminescerende substrat-enzymreaktjonen genererer lys, som ligner på bioluminescens. De kjemiluminiscerende EIA-systemene er en klar forbedring i forhold til RIA, når det gjelder følsomhet, tidseffektivitet og enkelhet i prosedyre.
Chemiluminescensimmunoanalyser bruker kjemiluminescensgenererende molekyler som etiketter.
Jeg. Luminolderivater
ii. Acridiniumestere
iii. Nitrofenyloksalatderivater
iv. Rutheniumtri-bipridyl med tripropylamin for elektrokemiluminescens
v. I utgangspunktet er analysemetodene ikke forskjellige fra RIA / FIA.
