Kliniske bruken av flytcytometer
Klinisk bruk av flytcytometer!
1. Oppregning av forskjellige celler (som T-celle og B-celler).
2. Deteksjon av B-celleantigener og klassifisering av hematopoietisk malignitet (leukemier og lymfomer).
3. Deteksjon av antigener på overflaten av myeloidceller, som er nyttig ved diagnosen myelodysplastiske syndromer og myeloid leukemi.
4. CD34 molekyler uttrykkes på overflaten av hematopoietiske stam-stamceller. Stamceller isolert fra beinmarg eller perifert blod er oppregnet ved å bruke merkede mAbs til CD34, slik at det nøyaktige antall stamceller kan beregnes og transfiseres til en pasient. De gjenværende stamceller lagres i flytende nitrogen og kan transfuseres senere til samme pasient, om nødvendig.
5. HLA-fenotyping Fluorkrom-merkede mAbs for hver HLA-antigen brukes til å binde med MHC klasse I og klasse II antigener på overflaten av celler. De fargede cellene blir deretter analysert (da cellene passerer som en enkelt kolonne) i strømningscytometeret.
6. Deteksjon av intracellulære antigener
Cellene behandles først med midler som gjør cellen gjennomtrengelig, uten å bryte cellen helt.
↓
Etterpå behandles cellene med milde konserveringsmidler for å koble sammen de cytoplasmatiske proteiner på plass og forhindre at de lekker ut av cellen.
↓
Deretter behandles cellene med merkede mAbs rettet mot intracellulære antigener. De merkede mAbene kommer inn i cellene og binder sammen med de intracellulære antigenene.
↓
Cellene ledes gjennom strømningscytometeret for å vurdere de farvede cellene.
Jeg. Påvisning av intracellulær terminal deoksynukleotidtransferase (TdT) bidrar til å definere tidlige B-celle-maligniteter. TdT er et enzym uttrykt under immunoglobulin gen-omarrangement som er ansvarlig for tilsetning av tilfeldige nukleotider ved kryssene av immunoglobulinsegmenter. Derfor indikerer uttrykk for TdT i en ondartet B-cellepopulasjon en meget umodentlig B-cellefenotype.
ii. Deteksjon av intracellulær myeloperoksidase hjelper i klassifiseringen av ulike subtyper av myeloide leukemi.
7. Analyse av DNA-innhold i celler. Flowcytometer kan vurdere mengden av genetisk materiale i en celle og bestemme S-fasefraksjonen eller mengden aneuploidi i en populasjon av celler, a. DNA-ploidi Normale celler som inneholder to kopier av kromosom kalles diploide celler.
Alle celler (unntatt ovum og sæd) som ikke er diploide, betraktes som aneuploid og kan tjene som en pålitelig indikator for neoplasi. Et stort antall celler i en svulst har en avvikende mengde DNA. Flowcytometrisk DNA-analyse utføres ved inkubering av permeabiliserte celler med fluorescerende fargestoffer (slik som propidiumjodid).
Fargestoffet interkalerer i DNA og fluorescerer. Mengden fluorescens er direkte proporsjonal med DNA-innholdet i cellen. Effektiviteten av kjemoterapi for malignitet hos en pasient kan vurderes ved ploiditetsanalyse. Ploidy-analyse bestemmer den totale mengden av nukleær DNA i individuelle tumorceller. DNA-indeksen er forholdet mellom DNA-fluorescens av tumorcelle og DNA-fluorescens av normal celle. DNA-indeksen for normal diploid celle er 1. DNA-indeks på mer enn mindre enn 1 indikerer en aneuploid tumor.
b. DNA-cellesyklusanalyse:
DNA-innholdet i celler ved forskjellige cellesyklusfaser under replikasjon (dvs. Gq / Gj-fase-DNA-syntesefase, S-fase-DNA-syntese, G2 / M fase-DNA-syntesefase) kan måles for å vurdere cellevekst og kreft aggressivitet. Mer DNA syntetiseres av aggressive kreftceller. Celler som går gjennom S-fasen, viser DNA-syntese som er direkte proporsjonal med aggressiviteten.
8. Mange leukocyttfunksjonelle analyser kan utføres med strømningscytometer.
Jeg. Produksjon av O2 - (superoksid) som en analyse for kronisk granulomatøs sykdom.
9. Deteksjon av celle-levedyktighet:
Fargestoffididjodidet kommer inn i celler som har brutte membraner og en forstyrret nukleær struktur. Derfor, med propidiumjodid, vil døde celler fluoresceres mens levende celler ikke fluorescerer. Videre er fluorescensen av propidiumjodid i den langt røde delen av spektret. Derfor kan denne metoden kombineres med vanlig mAb-farging, hvor de døde celler er farget rød og derfor kan utelates fra data-analysen.
10. Flowcytometriske metoder for å oppdage celler som gjennomgår apoptose er også tilgjengelige.
