HLA: Histokompatibilitetstestmetoder

Histokompatibilitetstestingsmetoder!

HLA-systemet er omfattende polymorf. Den polymorfe naturen til HLA alleler ble opprinnelig funnet og definert ved serologiske metoder og HLA antigenene ble gitt tall. Senere ble det funnet at antigener med samme serologiske spesifisitet kan ha forskjellige aminosyresekvenser. I 1999 oversteg antall kjente HLA alleler 1000, og tallet øker fortsatt. På grunn av den omfattende polymorfismen er nomenklaturen til HLA allelene kompleks, og det er også vanskelig for en person å forstå nomenklaturen, med mindre personen er i histokompatibilitetsfeltet.

De første sekvenserte allelene ble tildelt navn med to siffer som korresponderte med deres serologiske spesifisitet. De to første sifrene blir etterfulgt av ytterligere to siffer som angir kronologisk rekkefølge for navngivning av WHO-nomenklaturkomiteen for faktorer i HLA-systemet. (For eksempel. Den første allelen sekvensen fra et HLA-A2-gen ble kalt HLA-A 0201, og den andre allel-sekvensen ble kalt HLA-A 0202.)

HLA-typing gjøres ved serologiske typemetoder eller molekylære maskinskrivningsmetoder. De serologiske HLA-typemetoder oppdager epitoper av HLA-molekylene, mens molekylære metoder oppdager nukleotidsekvensene.

Jeg. HLA-typing som definerer grupper av alleler (vanligvis tilnærmende serologiske spesifisiteter) refereres til som lavoppløsnings- eller generisk skriving (for eksempel HLA-DRBl-04).

ii. Å skrive den løsningen alle kjente alleler kalles HLA-typing med høy oppløsning (for eksempel HLA-DR BI x401).

iii. Typing som løser utover serologiske spesifikasjoner, men som ikke oppnår allelivå, refereres til som mellomoppløsningstyping (for eksempel HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).

National Marrow Donor Programmet har opprettet kode for å lette styringen av disse komplekse mellomoppløsningsdataene. I dette systemet er navnet på HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / DRBl-04EJV.

Histokompatibilitetstesting ved serologiske metoder:

Lymfocytter brukes til serologisk HLA-typing, antistoff-screening og kryss-matching.

Isolering av lymfocytter for HLA-typing:

Jeg. Perifert venøst ​​blod blandes med Ficoll-Hypaque og sentrifugeres. Laget som inneholder mononukleære celler av perifert blod, aspireres, vaskes og anvendes.

ii. Lymfocytter isolert fra lymfeknuter og milt av cadavers brukes.

iii. HLA-typing for klasse II-antigener er gjort med berikede B-cellepopulasjoner (Omtrent 80 prosent av normale perifere blod-T-celler hviler T-celler som mangler klasse II-antigener på overflaten).

iv. Anti-CD2 eller anti-CD3 mAbs-belagte magnetiske perler brukes til å isolere T-celler; og anti-CD19 mAbs-belagte magnetiske perler brukes til å isolere B-celler.

Påvisning av HLA-antigener av lymfocytter:

Mikrocytotoksisitetsanalyse er en komplementavhengig lymfcytotoksisitetsanalyse. Frosne skrivebrett som inneholder brønner belagt med forskjellige antistoffer mot HLA-antigener, er kommersielt tilgjengelige.

Omtrent 2000 lymfocytter dispenseres i hver brønn i brettet og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur. (Antistoffer i hver brønn binder seg til spesifikke HLA antigener på overflaten av lymfocytter, hvis tilstede.)

↓

Fem μl komplement (vanligvis kaninserum) blir tilsatt til hver brønn og inkubert i 60 minutter (komplementproteiner forårsaker død av lymfocytter som er belagt med mAbs. I fravær av mAb-binding med lymfocytter blir komplementet ikke aktivert og lymfocyttene blir ikke drept).

↓

Fargen eosin Y, etterfulgt av formaldehyd (formaldehyd lagrer reaksjonen) tilsettes.

↓

Derefter teller de døde celler og levende celler i hver brønn under et fasekontrastmikroskop.

Jeg. Hovne og mørke celler er døde celler (Fargen eosin Y går inn i døde celler).

ii. Lys og refraktile celler er levende celler (Fargen eosin Y går ikke inn i levende celler).

Hver brønn i brettet ses individuelt for døde celler og levende celler. Prosentandelen av døde celler i hver brønn beregnes og scoring utføres i henhold til tabell 27.5.

Tabell 27.5: Scoring av lymfecytotoxicitetstesten for HLA:

HLA-typen av et individ bestemmes ved tolkning av reaksjonen av individets lymfocytter med forskjellig antisera anvendt i den komplement-avhengige lymfcytotoksisitetstest.

Jeg. Hvert individ forventes å ha to HLA-A, to HLA-B og to HLA-C-antigener på overflaten av lymfocytter.

ii. Hvis en person kun viser ett HLA-A- eller HLA-B- eller HLA-C-antigen i testen, er sannsynligvis det individ homozygot for det aktuelle antigenet eller antiserapanelet som brukes i testen, har ikke det spesifikke antistoffet mot det andre antigen eller det er lavt uttrykk for HLA-molekyler på lymfocyttoverflaten.

Den komplementavhengige lymfcytotoksisitetsanalysen for HLA-DR- og HLA-DQ-antigener utføres ved bruk av B-celler isolert av mAB-belagte magnetiske perler eller B-celler isolert over nylonull.

Det meste av HLA typesera er hentet fra flertallige kvinner. Siden de mutioparøse kvinnene gjentatte ganger er utsatt for FLA-legene HLA-antigener, har sera av de flerfagede kvinnene antistoffer mot HLA-antigener. Nesten 200 forskjellige antisera brukes til å skrive et individs HLA-antigener.

Det ble opprinnelig tenkt at mAbs til hvert HLA-antigen kunne utvikles og HLA-typing ville være enkelt. Men mange mAbs binder seg til de vanlige epitoperene heller til de private epitoper av HLA-antigenene. Videre fikser ikke mange murine mAbs komplement (og derfor er deres bruk i komplementavhengig-lymfcytotoksisitetsanalyser begrenset).

Imidlertid kan murine mAbs brukes i ELISA-metoden og flow-cytometri-metoden, som ikke krever komplement. For sent foretrekker mange laboratorier å bruke molekylær HLA-typing, snarere enn serologisk HLA-typing.

Screening Transplant Recipient Serum for Antistoffer mot l-ILA antigener (Antibody screening):

Tilstedeværelsen av antistoffer mot HLA-antigener i serum av en ventende organtransplantasjonsmottaker gjøres vanligvis ved komplementavhengig lymfecytotoxicitet. Lymfocytter med kjente HLA-antigener og komplement blandes med mottakers serum. Etter passende inkubasjon, tælles de døde lymfocytter og levende lymfocytter. Det prosentvise panelreaktive antistoffet (PRA) beregnes deretter.

PRA = Antall positive celler / Antall totale panelceller x 100

PRA indikerer omfanget av sensitisering av den venterende mottaker til HLA antigener.

ELISA-metode for å skjerme serum HLA-antistoffer:

ELISA-metoden er enkel, rask og krever ikke levende lymfocytter samt komplement. Affinitets-rensede HLA-antigener er belagt på veggene til mikrotiterplaten

↓

Mottakers serum blir tilsatt og inkubert

↓

Etter vask blir enzymkonjugert anti-humant IgG tilsatt og inkubert.

↓

Etter vask blir substrat tilsatt og inkubert.

Jeg. Utvikling av farge i en bestemt brønn indikerer tilstedeværelsen av IgG-antistoffer mot HLA-antigenet belagt på den aktuelle brønnen.

ii. Ikke-utvikling av farge i en bestemt brønn indikerer fraværet av antistoffer mot det spesielle HLA-antigenet belagt på den brønnen.

Flowcytometer for å oppdage serum HLA-antistoffer:

Mikroperler belagt med HLA-antigener inkuberes med pasientens serum og deretter med fluorescerende merkede anti-humane IgG-antistoffer. Prosent av perler som flekker over bakgrunnen, gir målet til pasientens prosentvise panelreaktive antistoffer (PRA).

Cross Matching:

Hvis blodet fra en ventende mottaker inneholder antistoffer mot donor-HLA-antigenene, vil HLA-antigenene på donorcellene bli angrepet av mottakers antistoffer ved transplantasjon. Derfor før transplantasjon er det viktig å vite om mottakeren har antistoffer mot donor HLA antigenene.

Hvis donor HLA-antigen-spesifikke antistoffer er tilstede i mottakers serum, vil transplantasjonen bli avvist. Kryssmatching er gjort for å detektere tilstedeværelsen av ventende mottakers serumantistoffer mot de foreslåtte donor-HLA-antigenene.

Lymfekutotoksisitet Kors som passer til perifert blodlymfocytter:

Perifert blodlymfocytter av den foreslåtte giveren (som omtrent inneholder 80 prosent T-celler (som bærer MHC klasse I antigener) og 20 prosent B-celler og monocytter (som bærer MHC klasse I- og klasse II-antigener) blandes med den ventende mottakers serum og inkuberes .

↓

Komplement blir tilsatt og inkubert.

↓

Fargestoffet Eosin Y tilsettes og inkuberes.

Jeg. Antallet døde og levedyktige celler regnes og prosentandelen av døde celler beregnes. 50 prosent eller mer celledød indikerer en sterk positiv tverrkamp (dvs. mottakers serum har antistoffer som er i stand til å reagere med donor HLA-antigener). En sterk positiv tverrkamp mellom en mottaker og en foreslått donor er en kontraindikasjon for organtransplantasjon fra giver til mottaker.

For å finne ut om mottakers antistoffer er rettet mot antigenene i klasse I eller klasse II, er henholdsvis T-celle lymfcytotoksisitet kryss-matching (ved hjelp av beriket T-celler) eller B-celle lymfcytotoksisitet kryss-matching (ved hjelp av berikede B-celler).

Flowcytometer-kryssmatching er 30-250 ganger mer følsom enn de visuelle serologiske metoder for påvisning av IgG-antistoffer mot HLA-antigener på overflaten av lymfocytter.

Perifere blodlymfocytter av den foreslåtte donoren inkuberes med merket (For eksempel, et fluorescerende fargestoff som avgir grønt lys) anti-CD3 mAbs, som binder til T-celler.

↓

De merkede ani-CD3-bundne T-celler separeres fra B-celler i strømningscytometeret.

↓

De separerte, fargete T-celler inkuberes nå med den ventende mottakers serum.

Jeg. Mottakers serumantistoffer mot donor-T-celle HLA-antigenene, hvis de er til stede, vil binde til T-cellene.

↓

Etter vasking er et flurokrom (som avgir en farge, annet enn grønn, si rød farge) merket anti-humant IgG tilsatt og inkubert.

ii. Den florokrom-merkede anti-humane IgG vil binde til mottakers HLA-antistoffer, som er bundet til donor-T-cellene.

Flytcytometeret teller antall T-celler (rød og grønn farge) og T-celler (grønn farge) og lager et histogram.

Krysspasning for autoantistoffer mot lymfocytter:

Under en tverrkamp kan autoantistoffer mot lymfocytter i mottakers serum bindes ikke spesifikt til donorlymfocyttene og gi et falsk positivt krysskampresultat; og dermed blir donoren feilaktig diskvalifisert fra donerende organ til den enkelte mottaker. Autoantistoffer kan også maskere tilstedeværelsen av spesifikke anti-donor antistoffer.

Tilstedeværelsen av autoantistoffer mot lymfocytter oppdages ved den automatiske tverrkampen, hvor mottakerens egne lymfocytter og serum kombineres i en standard cytotoksisitetstest. Autoantibody cross-kamper utføres rutinemessig sammen med alle levende donor-kryss-kamper for hvert serum som testes.

Molekylærbiologi Metoder for HLA-typing:

De fleste molekylære maskinskrivningsmetoder bruker polymerasekjedereaksjons-PCR-teknikk for å selektivt amplifisere HLA-gensegmentene som kreves for typing.

Sekvens-spesifikk Priming (SSP) Typing:

DNA fra individet ekstraheres fra celler eller vev

↓

DNA blir tilsatt til rør som inneholder forskjellige primersett for forskjellige HLA-gener. Et ekstra sett med primere er inkludert som en positiv kontroll av forsterkning i alle rørene.

`↓

De andre komponentene av PCR-reaksjon (som DNA-nukleotider, DNA-polymerase, buffer) tilsettes og termisk sykling utføres.

↓

De forsterkede produktene blir elektroforesert i gel med etidiumbromid og fotografert under UV-lys.

Jeg. Tilstedeværelse av bånd indikerer at DNA-prøven har sekvensen som tilsvarer den spesielle HLA-typen.

ii. Fravær av bånd indikerer at DNA-prøven ikke inneholder den spesielle sekvensen av HLA-typen.

iii. Det interne amplifikasjons kontrollbåndet bør være til stede for tolkning.

Setter av primere for HLA-typing er kommersielt tilgjengelige.

Jeg. For HLA-A, B og C-typing er det nødvendig med 100-200 reaksjoner.

ii. For HLA-DRB-skriving er det nødvendig med 20-30 reaksjoner.

Sekvens-spesifikk Oligonucleotide Probe Hybridization (SSOP):

SSOP-metoden innebærer selektiv amplifisering av HLA-målet etterfulgt av hybridisering til et panel av oligonukleotidprober. Det er to SSOP-formater.

Jeg. Prikk eller spalt blott:

Det amplifiserte DNA bindes til den faste bærer (som nylonmembran) og hybridiseringsproben er i oppløsning.

ii. Omvendt prikk eller spor:

Sonden er bundet til den faste bærer og hybridisert til det amplifiserte DNA i oppløsning.