Spore-farging av bakterier for å differensiere bakteriell spore og vegetativ cell

Hensikt:

Alle bakterier forblir i deres 'vegetative former', dersom miljøforholdene er gunstige for deres normale metabolske aktiviteter.

I dette skjemaet tar de opp næringsstoffer, vokser og reproduserer.

På den annen side dør de fleste av dem når miljøforholdene blir negative, for eksempel alvorlig forkjølelse, ekstrem varme, aldring, mangel på næringsstoffer, eksponering for stråling og giftige kjemikalier.

Imidlertid kan få arter av bakterier overleve under slike ugunstige forhold ved å forandre seg til svært resistente, metabolisk inaktive former kalt "sporer". Under ugunstige forhold produseres en spore i en vegetativ celle ved dehydrering og sammentrekning av dets celleinnhold.

Denne sporet, dannet inne i bakteriecellen, kalles 'endospore' (figur 2.13). Hvis ugunstige forhold forverres, brer cellen seg, frigjør endosporien, som nå blir en uavhengig dormant celle kalt 'spore'.

Spordannelsesprosessen kalles sporogenese. Sporet har tykke, relativt ugjennomtrengelige lag, som spore cortex og spore coat, som beskytter cellen mot enhver fysisk skade. Sporet får sin motstand ved flere mekanismer, som ennå ikke har blitt tydelig forklart.

Når forholdene blir gunstige, gir lagene som sporer rupturen og sporet opp til en metabolisk aktiv vegetativ celle. Denne prosessen kalles "spiring".

På grunnlag av evnen til å danne sporer, kan bakterier derfor deles inn i to grupper som følger:

(1) Spordannende bakterier (Sporeformere):

En bakterie, som kan produsere en spore for å overleve under ugunstige miljøforhold, er en spore-forming bakterier (spore-former). For det meste kan følgende tre slanger av stangformede bakterier produsere sporer under ugunstige miljøforhold.

A. Aerobe stangformede bakterier

1. Bacillus spp.

B. Anaerob stavformede bakterier

2. Clostridium spp.

3. Desulfotomaculum spp.

(2) Ikke-spordannende bakterier (ikke-sporeformere):

En bakterie, som ikke kan produsere en spore og derfor dør i sin vegetative form under ugunstige miljøforhold, er en ikke-spordannende bakterie (ikke-spore-former).

Formålet med spore-farging er å skille sporer og vegetative celler i en spore-former og å skille sporeformere fra ikke-sporeformere. Sporefarging er også nyttig ved identifisering av bakteriene som tilhører slægten Bacillus, Clostridium og Desulfotomaculum.

Prinsipp:

Sporene er forskjellige fra de vegetative cellene ved at de har tykke, relativt ugjennomtrengelige lag rundt dem (figur 2.14). Den primære flekken, malachittgrønn, kan ikke trenge inn i sporene gjennom disse lagene.

Derfor blir penetrasjonen av den primære flekken forsterket ved påføring av varme, som driver den gjennom dekklagene inn i sporprotokollen. Nå ser sporene grønt ut. Når sporene behandles med avfargingsmiddelet, kranvann, gjennomgår de ikke avfarvning, da de utelukker vann.

Kranvannet fjerner kun overskytende primærfarge som er tilstede i spores omgivelse. Sporene beholder således den grønne fargen. Deretter kan safraninmolekylene ikke komme inn i sporene gjennom dekklagene når de er motfargede med safranin. Således beholder sporene endelig den grønne fargen til den primære flekken og virker grønn.

På den annen side tar de vegetative bakteriecellene opp den primære flekken, malakittgrønn, enkelt, men flekken har ikke sterk affinitet for vegetative cellekomponenter, på grunn av hvilken den vaskes bort, når de avfarves under kranvann.

Nå ser de vegetative cellene fargeløs ut. Når de farges med safranin, tar de fargeløse vegetative cellene opp flekken og virker rød, i motsetning til sporer, som virker grønne.

Materialer som kreves:

Slide, sløyfe, malakittgrønn, safranin, spore-forming bakterier, kokeplater, mikroskop, nedsenking olje.

Fremgangsmåte:

1. Et lysbilde rengjøres ordentlig under kranvann, slik at vann ikke forblir som dråper på overflaten.

2. Det vedleggende vannet tørkes ut med bibulous papir og lysbildet lufttørkes.

3. Et smear av spordannende bakterier er laget i midten av et lysbilde i to metoder som angitt nedenfor.

(en) Hvis sporeformer vokst på agarplate eller agarskråning skal observeres, plasseres en dråpe vann i midten av lysbildet. En sløyfe steriliseres over flamme og en Clostridium-sløyfe av bakterier fra en eldre plate eller skråkultur (48-72 timer gammel) av spore-former, slik som Clostridium-supergener eller Bacillus subtilis, overføres til vanndråpet.

Deretter, ved forsiktig rotering av sløyfen i vanndråpet, blir en bakteriesuspensjon fremstilt og dråpen spredes til et smelte oppnås. Etter hvert som alder av sporeformende bakterier på plate eller skråkulturer øker, danner de sporer.

(B) Hvis sporeformet dyrket i væskebuljong skal observeres, blir kjøttkulturen, som bare inneholder vegetative celler, underkastet varmestrøm ved oppvarming på et vannbad i 15 minutter, slik at noen av de vegetative celler danner sporer for å overvinne varmefraktur. En dråpe av den blandede spor-vegetative cellesuspensjonen fra buljongkulturen plasseres direkte i midten av lysbildet ved en steril sløyfe og et smear blir fremstilt ved spredning.

4. Smøret er lufttørket.

5. Smøret er festet ved oppvarming. Oppvarming resulterer i koagulering av de cellulære proteiner, som cellene holder seg til glidoverflaten til og ikke blir vasket bort under farging. Varmefiksering gjøres ved raskt å passere glidebryterne høyt over en flamme 2-3 ganger med smøret overflaten vender oppover, slik at smøret ikke blir oppvarmet.

6. Smøret er oversvømmet med den primære flekken, malakittgrønn.

7. Lysbildet holdes på en varm kokeplate, og preparatet får lov til å dampe i 2-3 minutter. Temperaturen på kokeplaten er justert slik at preparatet ikke kokes og fordampes raskt. Fordampetapet er påfyllt, slik at smøret ikke blir tørket opp.

8. Glideren fjernes fra kokeplaten og avkjøles.

9. Smøret er avfarget ved å vaske under forsiktig vann fra springen, slik at vannet ikke faller direkte på smeten.

10. Smøret er oversvømmet med motflekken, safranin, i 30 sekunder.

11. Overflødig flekk blir helt vasket bort fra smøret under forsiktig strømmende vann fra springen, slik at vannet ikke faller direkte på smeten.

12. Lysbildet blottes tørt med bibulous papir.

13. Lysbildet er klippet til mikroskopets stadium og smøret observert under lavt strøm og høyt tørrmål.

14. En dråpe neddykkingsolje blir satt på smeten.

15. Smøret er observert under olje-nedsenkningsmål.