Western Blotting of Proteins
Western Blotting of Proteins!
Proteiner denatureres ved inkubering med et ionisk vaskemiddel (SDS: natriumdodecylsulfat) ved 100 ° C.
SDS jakker jevnt over alle proteiner og gjør overflatebelastningen av proteinene negativ.
↓
Det denaturerte proteinet blir deretter elektroforesert i polyakrylamidgel. Proteinene blir separert som forskjellige bånd, avhengig av molekylvektene.
↓
De separerte proteiner blir elektroforetiske allierte overført til et filterpapir (nylon eller nitrocellulose).
↓
Filterpapiret inkuberes deretter med antisera mot proteiner. Antistoffene binder til deres tilsvarende proteinantigener på filterpapiret og danner antigen-antistoffkomplekser.
↓
Filterpapiret vaskes for å fjerne ubundne serumkomponenter.
↓
Enzymmerket antiimmunoglobulin (kjent som konjugat) blir tilsatt til filterpapiret og inkubert.
↓
Konjugatet binder seg til antistoffet i antigen-antistoffkomplekset i filterpapiret.
↓
Filterpapiret vaskes for å fjerne ubundet konjugat og substrat tilsettes og inkuberes.
Jeg. Fargede bånd utvikler seg på steder der det er antigen-antistoffkomplekser.
iii. Ikke-utvikling av bånd antyder at det tilsvarende antistoff mot antigenet er fraværende i testserumet.
Filterpapirene som er impregnert med antigener, kan lagres i lengre perioder.
Western blot-analysen er mye brukt til å oppdage hepatitt C-virusantistoffer og som en bekreftende test for påvisning av antistoffer mot humant immunbristvirus (HIV).
Kommersielle selskaper impregnere filterpapir med separerte HIV-antigener og forsyne til laboratoriene. I laboratoriet blir pasientens serum tilsatt til filterpapiret og behandlet for å oppdage tilstedeværelsen av HIV-spesifikke antistoffer i serumet.
radioimmunoassay:
Radioimmunoassay (RIA) ble først utviklet av Rosalin Yalow og Berson (1959). Tallrike variasjoner i metoden er innført. Det er to hoved RIA teknikker, konkurransedyktig RIA og noncompetitive RIA.
Ulike radioisotoper brukes som etiketter (tabell 27.4) og de radioaktive utslippene måles i forhold til teller per minutt (CPM) ved hjelp av scintillasjonsteller. Den mest populære etiketten, 125 Jeg krever kortere tid for signal telling, men den har begrenset holdbarhet på grunn av den korte halveringstiden. Tritium ( 3 H) radioisotop krever lengre tid for telling og dermed øker den totale analysetiden.
Fordelene med RIA er:
Jeg. Presisjon og høy kvalitet
ii. Isotopforbøyning er lett
iii. Signal deteksjon uten optimalisering
Tabell 27.4: Egenskaper for radioisotoper som brukes i radioimmunoassay:
isotope | Halvt liv | Type forfall | Spesifikk aktivitet (mCi / μmol) |
125 I | 60 dager | γ | 2200 |
131 I | 8, 1 dager | Β-, γ | 16100 |
3 H | 12, 3 år | β- | 29 |
14 C | 5760 år | β- | 6062 |
32 s | 14, 3 dager | β- | 9120 |
Imidlertid har RIA følgende ulemper
Jeg. Kort halveringstid for reagenser
ii. Fare for radioaktivitet.
