Komplement Assays of Antigens and Antibodies

Komplement Assays of Antigens and Antibodies!

Metoder for nøyaktig bestemmelse av hver av komplementkomponentene i alle de tre komplementaktiveringsveiene og flere enzymer og regulatorer av komplement-systemet er tilgjengelige.

Imidlertid er mange av analysene bare tilgjengelige i forskningslaboratorier.

Det finnes to typer komplementanalyser:

1. Analyser som måler komplementproteiner som antigener.

2. Analyser som måler funksjonell aktivitet av komplement.

Analyser som måler komplementproteiner som antigener, er generelt enkle å utføre, billige, mindre tidskrevende og kan gjøres i mange laboratorier. Men disse antigenanalysene gir ikke informasjon om komplementkomponentens funksjonelle evner fordi disse komplement-antigenanalysene oppdager både funksjonelt aktive komplementkomponenter så vel som komplement nedbrytningsprodukter.

Jeg. Generelt er antigenanalyser ikke like følsomme som funksjonelle analyser.

ii. Antigeniske analyser oppdager ikke lave nivåer av komplementkomponenter i visse kroppsvæsker.

iii. ELISA-analyser er tilgjengelige for måling av splittede produkter av komplementkomponenter eller komplekser som dannes under komplementaktivering.

iv. Komplementaktivering via den klassiske banen kan måles ved å følge nivåene av C4d og C4 i serumet.

v. ELISA-måling av C1r-C1s-C1INH-komplekser gir et mål for komplementaktivering via klassisk vei.

vi. Aktivering av alternativ vei kan måles ved hjelp av ELISA-metoden ved å vurdere nivåene av Bb- eller C3bBbP-kompleksene i omløp.

vii. Aktivering av klassisk eller alternativ vei kan overvåkes ved å måle nivåene av iC3b eller den løsbare form av membranangrepskompleks sC5b6789.

viii. ELISA-sett for å måle anafylotaksinet C3a og C5a i serum eller plasma er tilgjengelige.

Eksempelhåndtering for komplementanalyser:

Riktig håndtering av prøver er kritisk for komplementfunksjonelle analyser. Noen av komplementkomponentene er svært labile.

Jeg. For de fleste funksjonelle analyser er serum, i stedet for plasma, foretrukket fordi kalsiumkelatatorene (som EDTA, heparin) som brukes til å oppnå plasma, kan være anti-komplementære.

ii. For funksjonelle analyser, bør blodet koagulere ved romtemperatur i 30-60 minutter og deretter på is i minst en time.

iii. For Clq bindingsanalyser bør blodet koagulere i 2 timer ved romtemperatur. Klumpen er rimmet og sentrifugert ved 0 ° C til 4 ° C i fem minutter. Hvis cryoprecipiterende antistoffer er mistenkt, må det oppstå koagulasjonsdannelse og sentrifugering av blodet ved 37 ° C fordi komplementfiksering kan oppstå hvis prøven avkjøles.

iv. Serum- eller plasmaprøver skal alikvoteres i flere små volumer og lagres umiddelbart ved 40 til -80 ° C.

v. Når sera overføres, skal de forsegles godt og plasseres i beholdere med store mengder tøris.

Komplement Funksjonelle analyser:

Buffrene anvendt i komplementfunksjonelle analyser er kritiske fordi endringer i molaritet og metallionskonsentrasjoner kan påvirke komplement-titerverdiene. CH _50- analyse for klassisk komplementbane: Den enkleste funksjonelle analysen av den klassiske banen måler total hemolytisk komplement.

Fraværet av noen av komplementkomponentene resulterer i en total hemolytisk komplementstiter (CH50) på null. Får erythrocytter blir vanligvis brukt som målceller for å måle CH50 eller den funksjonelle aktiviteten til isolerte komplementkomponenter. Får-RBC er mer følsomme for antistoff og komplement-mediert lys enn RBC av andre arter.

AH _50- analyse for alternativ komplementbane:

Kanin erythrocytter brukes til å måle AH ₅₀ . Kanin-RBC er følsomme for antistoff-uavhengig lysis mediert av humant serum.

Jeg. CH ₅₀ og AH ₅₀ analyser er gode screeningsanalyser for å utelukke genetisk mangel på komplementkomponenter.

ii. Normal CH ₅₀ aktivitet med reduserte AH _50- verdier skyldes defekter i alternativ komplementbane.

iii. Mangler i terminalkomplementkomponentene resulterer i tap av både CH ₅₀ og AH ₅₀ aktiviteter.

iv. Homozygot mangel på en komplementkomponent opphever totalt hemolytisk assay.

Graden av hemolyse påvirkes av mange faktorer, for eksempel erytrocytkonsentrasjonen, fraksjonen (alder) av erytrocytene, mengden antistoff som brukes til sensibilisering, antistoffets natur (IgG eller IgM), ionstyrken til buffersystemet, PH, reaksjonstid, temperatur og kalsium ²⁺ eller magnesium ²⁺ konsentrasjoner. Verdien for CH50-enheter i humant serum beregnes på flere måter, for eksempel Von krough-ligning.

Måling av funksjonell mangel på enkelte komplementkomponenter:

Når pasientens historie og symptomer antyder en mulig komplementkomponentmangel, kan hemolytiske titreringer av enkeltkomponent være påkrevd. For å frembringe lyser av erytrocytter er tilstedeværelse og aktivering av hele komplementkomponentene (C1-C9) nødvendig. Hvis en komponent er fraværende, forekommer ikke hemolyse. Rene preparater av hver enkelt komponentkomponentkomponent er nødvendig for å oppdage fraværet av en bestemt komplementkomponent i en patients serum eller plasma.

For å måle individuelle komplementkomponenter, er det nødvendig med delvis rensede komponenter. Måling av C4 er imidlertid et unntak, på grunn av tilgjengeligheten av C4-mangel (C4D) marsvin serum. Sera fra C2-mangelfulle mennesker og marsvin og C6-mangelskaniner er tilgjengelige i få laboratorier.

Funksjonelle komplementanalyser av individuell komponent er følsomme og gir nøyaktig informasjon om aktiviteten til en komplementkomponent. Men de fleste av disse analysene er begrenset til forskningslaboratorier.

Måling av individuell komplement-komponent ved antigenanalyse:

Enkelt radial immundiffusjon er den vanligste metoden for å kvantifisere komplementkomponenter, slik som C3, C4 og faktor B. Det skal huskes at alle komplementfunksjonelle analyser kan hemmes av anti-komplementær virkning av serum (som kan skyldes antigen- antistoffkomplekser, heparin, chelateringsmidler og aggregerte immunoglobuliner).

Komplementfikseringstest:

Når det er antigen-antistoffinteraksjon, blir komplementkomponentene aktivert og konsumert. Derfor indikerer in vitro testforbruk av komplement tilstedeværelsen av antigen-antistoffinteraksjon. Dette prinsippet brukes til å detektere og måle antigen eller antistoffer i komplementfikseringstesten.

Testen er ferdig i to trinn. I første fase skjer antigen-antistoffinteraksjon og komplementet forbrukes. I andre fase brukes et indikatorsystem til å oppdage om komplementet er forbruket eller ikke i første trinns reaksjon.

Jeg. Hvis komplementet forbrukes i første fase, betyr det at antigen-antistoffreaksjon har skjedd i første fase.

ii. Hvis komplement ikke forbrukes, betyr det at det ikke var antigen-antistoffinteraksjon i første fase.

Påvisning av antistoff ved komplementfikseringstest:

Første trinn:

Faste konsentrasjoner av kjent antigen og komplement (vanligvis fersk marsvin serum brukes som komplementkilde) er tatt. Serumet inneholder (ukjente antistoffer) tilsettes og inkuberes.

A. Kjent antigen + komplement + serum (tilsvarende antistoffer tilstede). Komplementet blir konsumert under inkubasjon.

B. Kjent antigen + komplement -1-serum (tilsvarende antistoffer fraværende). Komplementet forbrukes ikke fordi serumet ikke inneholder antistoffer som er spesifikke for det kjente antigenet.

Andre trinn:

Sau erythrocytter belagt med kanin anti-får erytrocyt antistoffer blir tilsatt til rørene. I tilstedeværelse av komplement vil får erythrocytes ved lysert (hemolyse). I fravær av komplement vil erytrocytene ikke lyse (ingen hemolyse).

A. Siden komplementet anvendes under første trinns reaksjon, blir ikke de antistoffbelagte får erythrocytter lysert. Derfor tilsier mangel på hemolyse at serumet inneholder spesifikke antistoffer mot antigenet som brukes i testen.

B. Siden komplementet ikke er brukt i det første trinn, blir de antistoffbelagte får erythrocytter hemolysert av komplementet i andre trinn. Derfor antyder tilstedeværelsen av hemolyse at serumet ikke inneholder spesifikke antistoffer mot det anvendte antigenet.

Komplementfikseringstester er mye brukt i kliniske laboratorier og forskning. Virus, serumantistoffer mot virale infeksjoner, antistoffer mot Treponema pallidum som forårsaker syfilis, antisvampantistoffer (Coccidioidomycosis immitis, Histoplasma capsulatum), anti-Mycoplasma pneumoniae antistoffer og anti-ricketsielle antistoffer påvises ved komplementfikseringstest.