Immunodiffusjon av antigen eller antistoffer

Immunodiffusjon av antigen eller antistoffer!

Immunodiffusjon refererer til bevegelse av antigen eller antistoff eller både antigen og antistoffmolekyler i et bærermedium ved diffusjon.

Antigenet og antistoffet binder seg til hverandre og danner uoppløselig immun-precipitat, som er synlig for det blotte øye som utfeltbånd eller -linje. J. Oudin beskrev et system for enkelt diffusjon av antigen og antistoff i agarfylte rør.

Snart beskriver Ouchterlony dobbel diffusjon i agar, lagret på lysbilder. Bevegelse er også beskrevet som enten lineær eller radial. Immunodiffusjonsmetodene brukes til kvalitativ og kvantitativ analyse av serumproteiner. Imidlertid har mer sensitive og spesifikke metoder som enzymbundet immunoabsorbentanalyse (ELISA) og radioimmunassay (RIA) nesten erstattet immunodiffusjonsmetodene.

Single Immunodiffusion:

Antingen eller antistoffet forblir løst og den andre reaktanten beveger seg (Diffusjonsteknikk av Oudin).

Double Immunodiffusion:

Både antigen og antistoff er fritt til å bevege seg mot hverandre. (Ouchterlony teknikk).

Smeltet agar helles på glassglass eller petridish og får størkne. To små brønner med få millimeter avstand fra hverandre er utstanset. Antigen og tilsvarende antistoffløsninger slippes i motsatte brønner. Lysbildet / petridishen holdes deretter i et fuktig kammer i 18-24 timer. Antigenet og antistoffet beveger seg gjennom agar og kombineres for å danne antigen-antistoffkompleks. Antigen-antistoffkomplekset er synlig som en utfellingslinje.

Doble diffusjon utføres også ved å plassere antigen- og antistoffbrønner i forskjellige vinkler for komparative formål. De tre mønstrene av disse reaksjonene er vist i figur 27.2.

Jeg. Identitetsreaksjon:

Antigener i to brønner er identiske (Agl og Ag2). Så resulterer reaksjonen med antistoffet i en nøyaktig lik precipitinlinje. Nedbørslinjene krysser ikke, men danner en kontinuerlig linje. Fusjon av de to precipitin-linjene indikerer at antistoffet reagerer med epitoper som ofte er tilstede på de to antigenene.

ii. Reaksjon av ikke-identitet:

To ikke-identiske antigener (Agl og Ag3) er i antigenbrønnene mens antistoffbrønnen har antistoffer mot begge antigenene. De to dannede antigen-antistoff-utfellingslinjene varierer fra hverandre. Derfor krysser de to presisjonslinjene helt (skjærer) hverandre.

iii. Reaksjon av delvis identitet:

Antigene determinanter i antigenene til to brønner deles delvis (Agl og Agla). Derfor reagerer antistoffet med både antigenene og formelinjene som ikke danner et komplett kors. Feltlinjen krysser i bare en retning. Den utvidede nedbørlinjen blir referert til som en spor. Sporen indikerer at antistoffet også utfeller en ekstra epitop som ikke er tilstede i et av antigenene.

Dobbel immunodiffusjon kan også brukes til halvkvantitativ analyse av antigen eller antistoff (figur 27.3):

Fig. 27.3:

Dobbel immunodiffusjon for halvkvantitativ analyse av antigen. Antistoff er plassert i sentralbrønnen og antigenet er plassert i forskjellige konsentrasjoner i de perifere brønner

Jeg. Kvantifisering av antigen:

Antigenet X blir serielt fortynnet og plassert i brønnene som omgir en sentral brønn inn i hvilket anti-X antistoff er plassert. Antigenet og antistoffet diffunderer ut av brønnene og reagerer med hverandre, noe som resulterer i dannelse av utfellinjer mellom antigen og antistoffbrønner. Mengden antigen-antistoffutfelling reduseres med reduserende mengder antigener i de forskjellige brønner. Derfor reduseres tykkelsen av utfeltlinjene ettersom antigenkonsentrasjonene reduseres.

ii. Kvantifisering av antistoff:

En prosedyre som ligner kvantifiseringen av antigen, anvendes, bortsett fra at posisjonen av antigen og antistoff endres. Antigenet plasseres i sentralbrønnen og antistoff ved forskjellige fortynninger plasseres i de utvendige brønner.

Single Radial Immunodiffusion:

Mancini introduserte denne nye teknikken for nøyaktig kvantifisering av antigener. Antistoffet blandes med smeltet agar og helles i en petriskål. Etter størkning av agar blir brønnene kuttet og fylt med forskjellige konsentrasjoner av antigen (figur 27.4).

Antigenet diffunderer ut av brønnen og danner antigen-antistoffkompleks-utfellingen i 48-72 timer. Bunnfallet ses som en hvit sirkulær linje rundt hver brønn. Diameteren til den sirkulære ringen er direkte proporsjonal med antigenkonsentrasjonen (dvs. mer antigenkonsentrasjonen, diameteren av utfellingen er mer).

En standardkurve kan plottes i et grafark ved å plotte de kjente antigenkonsentrasjonene i X-aksen og diameterene i Y-aksen. Testantigenet, hvis konsentrasjon er ukjent, kan bestemmes ved å interpolere standardkurven med diameteren av bunnfallet dannet av testantigenet.

Sensitiviteten til denne metoden er 1-3 ug / ml antigen. Denne metoden brukes til å kvantifisere konsentrasjonene av IgG, IgM eller IgA (ved å inkorporere i henholdsvis agar anti-IgG, anti-IgM eller anti-IgA antisera).