Trinn involvert i polymerase-kjedereaksjon i DNA-sekvens

Noen av de viktigste trinnene som er involvert i polymerasekjedereaksjon i DNA-sekvens er: 1. Trinn 1: Denaturering ved varme 2. Trinn 2: Annealing Primer til Target Sequence 3. Trinn 3: Forlengelse 4. Trinn 4: Slutten av den første PGR-syklusen .

Polymerasekjedereaksjonen (PGR) forsterker et enkelt stykke DNA over flere størrelsesordener, se figur 6.2. Det er opprettelsen av tusenvis til millioner av eksemplarer av en bestemt DNA-sekvens.

1. Trinn 1: Denaturering etter varme:

Varme er normalt mer enn 90 grader Celsius ved separering av dobbeltstrenget DNA i to enkeltstrenger. Denne prosessen er kjent som "denaturering". Hydrogenbindingene som knytter basene til hverandre er svake, derfor er denaturering mulig. Hydrogenbindingene bryter ved høye temperaturer, mens bindingene mellom deoksyribose og fosfater forbli intakte, da disse er sterkere forblir intakte.

2. Trinn 2: Annealing Primer til Target Sequence:

Det endelige målet med PGR er å replikere en målsekvens av ca. 100-600 basepar unike for organismen som studeres. Målretting av sekvensen oppnås ved å bruke primere. Primers markerer endene av målsekvensen.

AMPLICOR® Test primere er korte, syntetiske sekvenser av enkeltstrenget DNA som vanligvis består av 20-30 baser, med en biotin-merket 5'-ende for å hjelpe til med deteksjon. For målregionen av organismen er de spesifikke. PGR har to primere, en for hver av de komplementære enkelt-DNA-strengene som ble produsert under denaturering av enkelt-DNA-tråder som ble produsert under denaturering.

Begynnelsen av DNA-målsekvensen av interesse er preget av primere som anneal (bind) til den komplementære sekvensen. Annealing skjer vanligvis mellom 40 grader Celsius og 65 grader Celsius, avhengig av primers lengde og basesekvens.

3. Trinn 3: Forlengelse:

Temperaturen heves til ca. 72 grader Celsius etter at primrene er anneale til de komplementære DNA-sekvensene. Også enzymet Taq DNA-polymerase brukes til å replikere DNA-strengene. Taq DNA-polymerase er en rekombinant termostabil DNA-polymerase fra organismens Thermus-akvatika oss og i motsetning til normale polymerase-enzymer er det aktivt ved høye temperaturer.

Synteseprosessen syntetiserer nye dobbeltstrengede DNA-molekyler, begge identiske med det opprinnelige dobbeltstrengede mål-DNA-området, ved å legge til rette for binding og sammenføyning av de komplementære nukleotidene som er frie i løsning (dNTPer). Forlengelsen begynner alltid ved 3'-enden av primeren som danner en dobbel streng ut av hver av de to enkeltstrenger. Taq DNA-polymerase syntetiserer utelukkende i 5'-til-3'-retningen.

4. Trinn 4: Slutten av den første PGR-syklusen:

Det er nå to nye DNA-tråder som er identiske med det opprinnelige målet ved slutten av den første PGR-syklusen. De nyformede strengene har en begynnelse, som nettopp er definert av 5'-enden av primeren, men 3'-enden er ikke nøyaktig definert.

DNA-strengen syntetisert fra en slik mal har da en nøyaktig definert lengde som er begrenset i hver ende ved 5'-enden av hver av de to primere. Disse DNA-strengene er kjent som AMPLIGON. DNA-tråder som korresponderer med målsekvensen. Etter bare noen få sykluser, finnes det i mye større tall enn variabel lengde sekvensene. Sekvensen flankert eller definert av de to primere er delen som forsterkes.